.jpg)
لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 10
بررسی جهش های ژن شایع بتا گلوبین در بیماران مبتلا به تالاسمی ماژور
در استان خوزستان به روش RDB
چکیده
هدف: بتا تالاسمی از شایع ترین بیماریهای ارثی تک ژنی ایران است. ایران روی نقشه کمربند تالاسمی جهانی قراردارد و حدود 5 تا 10 درصد جمعیت آن ناقل بتا تالاسمی هستند استان خوزستان دارای جمعیتی از اقوام مختلف است هدف این تحقیق تعیین فراوانی الگوهای جهش های ژنی بتا تالاسمی در استان خوزستان جهت پیشگیری قبل از تولد به شکل مقطعی آینده نگر در میان مراجعین به مرکز تحقیقات تالاسمی و هموگلوبینوپاتی ارجاع شده اند انجام گردید.
روش بررسی: برای این مقصود 116 بیمار مبتلا به بتا تالاسمی ماژور را که در نواحی مختلف استان خوزستان زندگی می‌کردند با نمونه گیری ساده در بیماران مراجعه کننده مورد مطالعه قرار گرفت. در این تحقیق از روشRDB 1 استفاده شد و از هر بیمار 5 میلی لیتر خون حاوی EDTA2 برای تجزیه DNA3 گرفته شده است. آزمایش با استفاده از کیت شرکت (Vinea – Lab ) انجام گردید.
یافته ها: شایع ترین جهش های مشا هده شده در این گزارش عبارتند از : کدون37/36 (7/14 درصد) و جهش IVSI -110 (2/14 درصد ) وجهش IVS11-1 (9/6درصد )، کدون 8 (5/6درصد) کدون 5 (2/5درصد)، سایر موارد (31درصد) ، ناشناخته ها (6/21 درصد) بودند.
نتیجه‌گیری : شایع ترین جهش های شناسایی شده در این مطالعه در خوزستان کدون 36 /37 با 7/14 درصد است.
کلید واژه‌گان: بتا تالاسمی ماژور، RDB ،جهش یابی
1-Revers Dot Blot Hybridization
2-Etylendiamin Tetra Acetic Acid
3-Deoxy Ribonucleic Acid
ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
*کارشناس ارشد ژنتیک، گروه بیوشیمی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز
**دانشیارگروه میکروب شناسی ویروس، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز
*** استاد گروه میکروب شناسی ویروس، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز
****استاد گروه کودکان خون وسرطان، مرکز تحقیقات تالاسمی و هموگلوبینوپاتی دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز
1- نویسنده مسؤل
دریافت مقاله: 7/11/1385 دریافت مقاله اصلاح شده: 23/2/1386 اعلام قبولی: 29/3/1386
مقدمه
تالاسمی بتا بعلت کمبود نسبی سنتز زنجیره بتا گلوبین بوجود می آید. در سال 1378 تعداد مبتلایان به تالاسمی ماژور در ایران20 هزار نفر تعداد افراد ناقل 2 تا 3 میلیون نفر گزارش شده است(8). یکی از راه های پیشگیری از تولد بیماران مبتلا به تالاسمی بتا تشخیص قبل از تولد و انجام سقط درمانی می باشد و یکی از گامهای اولیه و ضروری برای این امر شناسایی جهش های شایع در هر قومیت است. چون مطالعه ای جامع که بتواند تمام جمعیت استان خوزستان را در برگیرد تاکنون انجام نگرفته است تصمیم به انجام این تحقیق پیلوت گرفته شد این تحقیق با استفاده ازروش Reveres Dot Blot انجام گرفت.
روش بررسی
بیماران از تمام استان خوزستان بصورت نمونه گیری خوشه ای انتخاب شدند.( جدول 1 ). از هر بیمار 5 میلی لیتر خون در لوله های حاوی EDTA تهیه و برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. آزمایش ها با استفاده از کیت شرکت Vienna Lab ساخت اتریش انجام گردید این کیت دارای تمام مواد مورد نیاز برای انجام آزمایش می باشد. مواد تکمیلی کیت از جمله آنزیم Taq به آن اضافه گردید. هر کیت برای 20 تست طراحی شده بود و هر تست 22 جهش بتا گلوبین را شناسایی می نماید. عمل PCR 1 با شرایط زیر انجام شد.
Pre-PCR: 94˚C/2 min
PCR: [94˚C/10 sec. – 54˚C/15 sec. – 72˚C/45 sec.] – 35 cycles
Final extension: 72˚C/3 min
بعد از انجام PCR محصول آن بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفورز گردید و مشاهده سه باند با اندازه‌های 738 و 596 و 251 جفت بازی دلالت بر موفقیت آمیز بودن مرحله PCR داشت. در مرحله بعدی عمل هیبرید بین محصول PCR و نوار مخصوص کیت انجام می‌گرفت. این عمل باید در دمای دقیق 45˚C در بن ماری انجام شود. در این مرحله که با کمک محلولها کیت انجام می گرفت بر روی نوار مخصوص کیت نوارهای بنفش تیره ظاهر می شدند که با قرار دادن نوار در جدول مخصوص و بررسی نوارهای ظاهر شده نوع جهش بیماران مشخص می گردید.
یافته ها
در این تحقیق 116 بیمار مبتلا به تالاسمی ماژور مورد آنالیز قرار گرفتند. 51درصد آنها دختر و 49درصد پسر بودند. معدل سنی دختران 51/14سال و پسران 28/15 سال بود.7/42درصد بیماران والدین غیر خویشاوند و 3/57درصد آنها والدین خویشاوند داشتند. چون هر فرد دو کروموزوم حاوی ژن بتاگلوبین دارد بنابرین در مجموع 232 کروموزوم مورد بررسی قرار گرفت و انواع جهشهای این بیماران در جدول زیر گرد آوری شده است
جدول 1 : تعداد بیماران انتخاب شده از مناطق مختلف استان خوزستان
منطقه در استان خوزستان
تعداد
درصد
1- اهواز (مرکز خوزستان )
70
35درصد
2-شوشتر - دزفول – اندیمشک - مسجد سلیمان - رامهرمز (شمال خوزستان )
61
5/30درصد
3- خرمشهر - آبادان (جنوب غرب خوزستان )
36
18درصد
4- شادگان (جنوب خوزستان )
18
9درصد
5- دشت آزادگان (غرب خوزستان )
15
5/7درصد
جمع
200
100درصد
1-Polymerization Chain Reation
جدول 2 : فراوانی و درصد انواع جهش های بتا تالاسمی در استان خوزستان
نام جهش
فراوانی
درصد
Condon 36/37
34
7/14درصد
IVS-I -110
33
2/14درصد
IVS – II -1
16
9/6
Condon 8
15
5/6
Codon 5
12
2/5
IVS-I – 25
12
2/5
Codon 44
10
3/4
Codon 8/9
9
9/3
IVS-I -5
8
4/3
Hemo S
7
0/3
IVS-I -745
5
2/2
IVS-I -6
5
2/2
Codon 22
5
2/2
IVS-I -2
4
7/1
- 30
2
9/0
IVS-I -116
2
9/0
Codon 39
2
9/0
Codon 30
1
4/0
ناشناخته
50
6/21درصد
جمع
232
100
جدول 3 : فراوانی جهش های ژن بتا گلوبین بیماران تالاسمی در دو جمعیت عرب و غیر عرب زبان
نام جهش
جمعیت غیر عرب زبان
جمعیت عرب زبان
جمع
Codon 36/37
(درصد3 /17) 14
(درصد 2/8) 8
(درصد 3/12) 22
IVS-I-110
(درصد6/8) 7
(درصد 2/25) 25
(درصد 9/17) 32
IVS-II-1
(درصد9/4) 4
(درصد 3/14) 14
(درصد 1/10) 18
Codon 8
(درصد4/7) 6
(درصد 1/4) 4
(درصد 6/5 ) 10
Codon 5
(درصد6/8)7
(درصد 1/3) 3
(درصد 6/5 ) 10
IVS-I- 25
(درصد 4/7) 6
(درصد 1/5) 5
(درصد 1/6) 11
Codon 44
(درصد0/0)0
(درصد 1/4) 4
(درصد 2/2) 4
Codon 8/9
(درصد 9/4)4
(درصد 1/3) 3
(درصد 9/3) 7
IVS-I- 5
(درصد 5/3) 3
(درصد 0/2) 2
(درصد 8/2) 5
Hemo S
(درصد 2/1) 1
(درصد 1/4) 4
(درصد 8/2) 5
IVS 2/745
(درصد 2/1) 1
(درصد 0/0) 0
(درصد 6/0) 1
IVS-I -6
(درصد7/3) 3
(درصد 0/2) 2
(درصد 8/2) 5
Codon 22
(درصد7/3) 3
(درصد 0/1) 1
(درصد 2/2) 4
IVS-I-2
(درصد 0/0)0
(درصد 0/0) 0
(درصد 0/0) 0
30-
(درصد 5/2) 2
(درصد 0/0) 0
(درصد 1/1) 2
IVS-I-116
(درصد 2/1) 1
(درصد 0/1) 1
(درصد 1/1) 2
Codon 39
(درصد 2/1) 1
(درصد 0/1) 1
(درصد 1/1) 2
Codon 30
(درصد 0/0) 0
(درصد 0/0) 0
(درصد 0/0) 0
ناشناخته
(درصد2/22) 18
(درصد 4/21)21
(درصد 8/21 ) 39
جمع
(درصد100)81
(درصد 100)81
(درصد 100) 179
بحث
انواعی از جهش ها در ژن زنجیره بتا گلوبین منجر به بیمار تالاسمی میگردند. اگرچه شیوع آ ن ها در مناطق مختلف متفاوت می باشند و توزیع جغرافیایی آنهادر بعضی نقا ط بیشتر است مثلا جهش 619 bp deletion بیشتر در شمال هندوستان و جهش های IVS-I-110 و IVS-II-1 بیشتر در اقوام عرب یافت می شود(12و6). از طرفی در طول تاریخ جنگهای بین ممالک اتفاق افتاده و نیز روابط تجاری بین آنان مبادله ژنها را بین اقوام مختلف سبب شده است. موقعیت جغرافیایی ایران بگونه ای است که از دیر باز مورد حمله اقوام مختلف قرار گرفته است. در تاریخ باستان بارها جنگ هایی بین ایران و یونان و نیز ابران و روم رخ داده است. بعدها اعراب و پس از آن مغولها به ایران وارد شده و به همراه خود ژنهای خود را وارد جامعه ساخته اند. مرزهای شرقی و جنوب شرقی ایران و نیز راههای آبی جنوب کشور محل تردد بازرگانان بوده است. از اینرو شگفت آور نیست اگر جهش هایی از بتا تالاسمی با وفور جغرافیایی ویژه نظیر جهش های مدیترانه ای و یا عرب و یا مغول در ایران یافت شوند. مهم ترین یافته این تحقیق این بود که شایعترین جهش بتا تالاسمی کدون 36/37 است این چهش در 7/14 درصد کروموزومهای بررسی شده مشاهده گردید . در رتبه های بعدی جهش IVS-I-110 در 2/14 درصد و IVS-II-1 در 9/6 درصد موارد مشاهده شده است (جدول 2 )
بر طبق گزارش ( 10) بررسی 87 بیمار مبتلا به بتاتالاسمی انترمدیت به روش ARMS نشان داد که جهش های IVS-II-1 و IVS-I-110 و IVS-I-1 و Fr8/9 شایعترین جهش ها در استان فارس هستند و جهش IVS-II-1 شایعترین جهش (24درصد) برای استان فارس معرفی شده بود. بر طبق نتایج ما شایعترین جهش در استان خوزستان کدون 36/37 می باشد و جهشهای IVS-II-1 در مرتبه دوم و سوم قرار دارد. شایعترین جهش در بوشهر IVSI-3end(-25bp de) با 41/29 درصد در بررسی است که با کشور امارات هم خوانی دارد و جهش IVS11-1 GA در مرحله دوم است و دلیل احتمالی این تفاوت ناشی ازارتباط قدیم بوشهر با امارات درطول تاریخ می باشد*.
همچنین در مطالعه دیگری که توسط نجم آبادی روی 1217 نفر بیمار مبتلا به بتا تالاسمی انجام شده بود مشخص کرد که در شمال ایران IVS-II-1 با فراوانی 34درصد شایعترین جهش است و در جنوب ایران از فراوانی این جهش کم شده و فراوانی جهش IVS-I-5 بیشتر میشود. به طوری که شایعترین جهش جنوب ایران IVS-I-5 گزارش شده بود( نجم آبادی 2001).
مقایسه نتایج این تحقیق با گزارشات منتشر شده قبلی تفاوتی آشکار را برای شایعترین جهش جنوب ایران نشان می دهد. بدین صورت که در تحقیق کریمی شایعترین جهش برای جنوب ایران IVS-II-1 گزارش شده بود ولی در گزارش نجم آبادی شایعترین جهش جنوب ایران IVS-I-5
*استان لارستان تا زمان زندیه به جای( استان های فارس بوشهر هرمزگان کنونی به اضا فه کل مساحت امارات عربی بوده) است مرجع(نقشه ایراندرزمان نادر شاه افشاردر آرامگاه نادرشاه در شهر مشهد) بنا بر این ارتباط شما ل خلیج فارس با جنوب آن یک امر بدیهی بوده است
معرفی شده بود و در تحقیق حاضر جهش Codon36/37 و0 IVSI-IIشایعترین شناخته شد و در گزارش فدائی از استان بوشهرجهش IVS1-3 end (25 bp del ). شایع ترین جهش می باشد البته ممکن است این تفاوت ها ناشی از این باشد که در تحقیقات قبلی محل انجام تحقیق در تهران و شیراز بوده است و نمونه گیری از جنوب ایران شامل تمام استانهای جنوبی از خوزستان تا بوشهر و هرمزگان و غیره نبوده است و با نتایج تحقیق ما که نمونه ها صرفا از استان خوزستان انتخاب شده اند تفاوت نشان دهد. بنابراین نتایج این تحقیق بدلیل نمونه گیری صرف از استان خوزستان به واقعیت نزدیکتر است.
همچنین تحقیقاتی مشابه در استان هرمزگان در جنوب ایران توسط یاوریان برای تعیین الگوی جهش ها انجام شده است. فراوانترین جهش IVS-I-5 با فراوانی 69درصد و در مرتبه بعدی IVS-II-1 با فراوانی 6/9درصد گزارش شده است که با گزارش نجم آبادی تطابق بیشتری دارد (یاوریان 2001).
با وجود قرار گرفتن هر دو استان هرمزگان و خوزستان در جنوب ایران تفاوت زیادی بین الگوی جهش ها در آنها مشاهده میشود و این تفاوت احتمالا بدلیل مجاورت خوزستان با کشورهای عرب و انتقال احتمالی ژن از آن کشور ها به ایران است.
البته مطالعه ای که در 8 کشور عربی برای تعیین الگوی جهش ها انجام گرفته است نشان میدهد که جهش IVS-I-110 و IVS-II-1 شایعترین جهش ها در این کشورها هستند و جهش IVS-I-5 و Codon 39 و Codon6 و Del 25bp در مرتبه های بعدی قرار دارند(6).
در مطالعه ای در کشور کویت شایعترین جهش ها که در 64 درصد موارد مشاهده شده بود بترتیب شامل جهشهای IVS-II-1 و IVS-I-6 و CD39 و IVS-I-110 و CD8 و IVS-I-1 بود و دو جهش ایرانی-کردی CD44 و Codon36-37 در 10 درصد افراد وجود داشت. جهش Codon36-37 که در کویت مشاهده شده است همان جهشی است که در خوزستان شایعترین جهش شناخته شد(1).
نکته دیگر اینکه بر خلاف دیگر نقاط دنیا که تعداد اندکی جهش در درصد زیادی ازجهش های بیماران تالاسمیک دیده می شود در این استان پراکندگی انواع جهش ها بالا است و 4 جهش شایع یعنی Codon36/37 و IVS-I-110 و Codon8 و IVS-II-1 تنها در 42 درصد بیماران مشاهده میشود. این مسئله پراکندگی انواع جهش‌ها را در استان خوزستان نشان میدهد که دامنه وسیع نیاز به تحقیقات را در آینده نشان می دهد.
نتایج این تحقیق می تواند بعنوان راهنمایی برای شناسایی جهش ها و تشخیص قبل از تولد تالاسمی مورد استفاده قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
1-بدینوسیله نویسندگان از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز که هزینه انجام این طرح را تقبل نمودند تشکر و قدردانی می نمایند.
2-از خانم صالحه شانه مدیریت بخش تالاسمی، خانم پور عطیه منشی بخش تالاسمی جهت جمع آوری تهیه 70 نمونه تشکر و قدردانی می شود.
منابع
1- Adekile AD, Gu LH, Bayasal E, Hiader MZ, al-Fuzae L, Aboobacker KC, al-Rashied A, Huisman TH. Molecular characterization of alpha- thalassemia determinants, beta- thalassemia alleles , and beta S haplotypes among Kuwaiti Arabs. Acta Haematol 1994;92(4):176-81.
2-Akhavan – Niakia H, Hashemi AB, Mohammad –Jafari N, Asgari B. Rapid and accurate prenatal diagnosis of thalassemia in Iran. HGM 2002; poster abstract 7, Medical Genomics.
3- Angastinotis M, Modell B, Global epidemiology of hemoglobin disorders . Ann NY Acod Sci 1998;850:251-69.
4- Chehab F, et al . Detection of multiple cystic fibrosis mutations by reverse dot blot hybridization : technology for carrier screening . Human Genet 1992;89:163-8.
5-Curuk MA, Yuregir GT, Asadow CD, Dasasova T, Gu LH, Bayasal E, Gu YC, Riberio ML, Huisman TH. Molecular charactrization of beta- thalassemia in Azerbaijan. Hum Geet.1992;90(4):417-9.
6-El-Hazmi MA, Warsy AS, Al-wailem AR. The frequency of 14 beta thalassemia mutations in the Arab populations. Hemoglobin 1996;19(6):353-60.
7-Gulesken S, Oren H, Vergin C, Anli N, Gulen H, Ucar C, Irken G. Mutational analysis of beta – thalassemia cases from the Aegean region of Turkey using an allele-specific oligonucleotide hybridization technique. Acta Haematol 2000;104(4):181-4.
8-Habibzadeh F, Yadollahie M, Meart A, Haghshenas M, Thalassemia in Iran; an overview. Archive of Iranian Medicine 1998;1(1):1-9.
9- Huisam TH, Carver M, Baysal E A syllabus of Thlassemia Mutations. Sickle Cell Anemia USA: Foundation in Augusta; 1997.
10- Karimi M , Yarmohammadi H, Farjadian S, Zeinali S, Mofhaddan Z, Cappellini MD, Giordano PC. Beta- Thalassemia intermediate from southern Iran : IVS-II-1(G A) is the prevalent thalassemia intermediate allele . Hemoglobin 2002; 26(2)147-54.
11- Khan SN , Riazuddin S. Molecular charactization of beta-thalassemia in Pakistan. Hemoglobin 1998; 22(4):333-45.
12- Madan N , Sharma S, Rusia U, Sen S, Sook SK. Beta- Thalassemia Mutations in northen India (Dehli). Indian J Med Res 1998;107:134-41.
13- Maggio A, Giambonu A, Cais P, Wall J, Kan YW, Chehab FF. Rapid and simulateous typing of hemoglobin S, hemoglobin C, and seven Mediterranean B- Thalassemia mutations by by covalent reverse dot blot analysis: application to prenatal diagnosis in Sicily. BL 1993;239-242.
14- Najmabadi H, Karimi- Nejad R, Sahebjam S, Pourfarzad F, Teimourian S, Sahebjam F, Amirizadeh N, Karimi-Nejad MH. The beta – Thalassemia mutation spectrum in the Iranian population . Hemoglobin 2001;25(3):285-96.
15- Papapanagiotou E, Doumas D, Balasopoulous A, Patrinson GP, Papadakis MN, IN:16 the Panhelenic congress or the Greek Society of Biological Sciences. 1994;7-10.
16- Rosatelli MC, Tuveri T, Sealas MT, et al. Molecular screening and fetal diagnosis of beta- thalassemia in the Italian population. Hum Gen 1992;89:585-9.
17- Saiki RK, Walash PS, Levenson CH, Erlich HA, Genetic analysis of amplified DNA with immobilized equence specific oligonucleotide probs.proc Natl Acad Sci 1989;86:6230-4.
18- Tadmouri GO, Tuzmen S, Ozcelik, et al. Molecular and population genetics analysis of beta – thalassemia in Turkey . Am J Hematol 1998;57:215-220.
19- Weatheral DJ. ABC of clinical hematology . The hereditary anemia's. BMJ 1997;314:492-6.
20- Weatheral DJ. The Thalassemia in : stamatoyannopoulos G, Nienhuis AW, Majerus PW,Varmus H, eds. The molecular Basis of blood diseases , Philadelphia: WB .Sanders; 1994. P.157-205.
21- Winichagoon P, Saechan V, Sirpanich R, Napparptana C, Kanikpongsakdi S, Maggio A, Fucharoen S. Prenatal diagnosis of beta- thalassemia by reverse dot –blot hybridization. Prenatal Diagnosis 1999;19(5):428-35.
22- Wood WG. The complexities of b-globin in gene mutation regulation. Trends Genetic 1996;12:204-6.
مقدمه
تالاسمی بتا بعلت کمبود نسبی سنتز زنجیره بتا گلوبین بوجود می آید. در سال 1378 تعداد مبتلایان به تالاسمی ماژور در ایران20 هزار نفر تعداد افراد ناقل 2 تا 3 میلیون نفر گزارش شده است(8). یکی از راه های پیشگیری از تولد بیماران مبتلا به تالاسمی بتا تشخیص قبل از تولد و انجام سقط درمانی می باشد و یکی از گامهای اولیه و ضروری برای این امر شناسایی جهش های شایع در هر قومیت است. چون مطالعه ای جامع که بتواند تمام جمعیت استان خوزستان را در برگیرد تاکنون انجام نگرفته است تصمیم به انجام این تحقیق پیلوت گرفته شد این تحقیق با استفاده ازروش Reveres Dot Blot انجام گرفت.
روش بررسی
بیماران از تمام استان خوزستان بصورت نمونه گیری خوشه ای انتخاب شدند.( جدول 1 ). از هر بیمار 5 میلی لیتر خون در لوله های حاوی EDTA تهیه و برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. آزمایش ها با استفاده از کیت شرکت Vienna Lab ساخت اتریش انجام گردید این کیت دارای تمام مواد مورد نیاز برای انجام آزمایش می باشد. مواد تکمیلی کیت از جمله آنزیم Taq به آن اضافه گردید. هر کیت برای 20 تست طراحی شده بود و هر تست 22 جهش بتا گلوبین را شناسایی می نماید. عمل PCR 1 با شرایط زیر انجام شد.
Pre-PCR: 94˚C/2 min
PCR: [94˚C/10 sec. – 54˚C/15 sec. – 72˚C/45 sec.] – 35 cycles
Final extension: 72˚C/3 min
بعد از انجام PCR محصول آن بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفورز گردید و مشاهده سه باند با اندازه‌های 738 و 596 و 251 جفت بازی دلالت بر موفقیت آمیز بودن مرحله PCR داشت. در مرحله بعدی عمل هیبرید بین محصول PCR و نوار مخصوص کیت انجام می‌گرفت. این عمل باید در دمای دقیق 45˚C در بن ماری انجام شود. در این مرحله که با کمک محلولها کیت انجام می گرفت بر روی نوار مخصوص کیت نوارهای بنفش تیره ظاهر می شدند که با قرار دادن نوار در جدول مخصوص و بررسی نوارهای ظاهر شده نوع جهش بیماران مشخص می گردید.
یافته ها
در این تحقیق 116 بیمار مبتلا به تالاسمی ماژور مورد آنالیز قرار گرفتند. 51درصد آنها دختر و 49درصد پسر بودند. معدل سنی دختران 51/14سال و پسران 28/15 سال بود.7/42درصد بیماران والدین غیر خویشاوند و 3/57درصد آنها والدین خویشاوند داشتند. چون هر فرد دو کروموزوم حاوی ژن بتاگلوبین دارد بنابرین در مجموع 232 کروموزوم مورد بررسی قرار گرفت و انواع جهشهای این بیماران در جدول زیر گرد آوری شده است
جدول 1 : تعداد بیماران انتخاب شده از مناطق مختلف استان خوزستان
منطقه در استان خوزستان
تعداد
درصد
1- اهواز (مرکز خوزستان )
70
35درصد
2-شوشتر - دزفول – اندیمشک - مسجد سلیمان - رامهرمز (شمال خوزستان )
61
5/30درصد
3- خرمشهر - آبادان (جنوب غرب خوزستان )
36
18درصد
4- شادگان (جنوب خوزستان )
18
9درصد
5- دشت آزادگان (غرب خوزستان )
15
5/7درصد
جمع
200
100درصد
مقدمه
تالاسمی بتا بعلت کمبود نسبی سنتز زنجیره بتا گلوبین بوجود می آید. در سال 1378 تعداد مبتلایان به تالاسمی ماژور در ایران20 هزار نفر تعداد افراد ناقل 2 تا 3 میلیون نفر گزارش شده است(8). یکی از راه های پیشگیری از تولد بیماران مبتلا به تالاسمی بتا تشخیص قبل از تولد و انجام سقط درمانی می باشد و یکی از گامهای اولیه و ضروری برای این امر شناسایی جهش های شایع در هر قومیت است. چون مطالعه ای جامع که بتواند تمام جمعیت استان خوزستان را در برگیرد تاکنون انجام نگرفته است تصمیم به انجام این تحقیق پیلوت گرفته شد این تحقیق با استفاده ازروش Reveres Dot Blot انجام گرفت.
روش بررسی
بیماران از تمام استان خوزستان بصورت نمونه گیری خوشه ای انتخاب شدند.( جدول 1 ). از هر بیمار 5 میلی لیتر خون در لوله های حاوی EDTA تهیه و برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. آزمایش ها با استفاده از کیت شرکت Vienna Lab ساخت اتریش انجام گردید این کیت دارای تمام مواد مورد نیاز برای انجام آزمایش می باشد. مواد تکمیلی کیت از جمله آنزیم Taq به آن اضافه گردید. هر کیت برای 20 تست طراحی شده بود و هر تست 22 جهش بتا گلوبین را شناسایی می نماید. عمل PCR 1 با شرایط زیر انجام شد.
Pre-PCR: 94˚C/2 min
PCR: [94˚C/10 sec. – 54˚C/15 sec. – 72˚C/45 sec.] – 35 cycles
Final extension: 72˚C/3 min
بعد از انجام PCR محصول آن بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفورز گردید و مشاهده سه باند با اندازه‌های 738 و 596 و 251 جفت بازی دلالت بر موفقیت آمیز بودن مرحله PCR داشت. در مرحله بعدی عمل هیبرید بین محصول PCR و نوار مخصوص کیت انجام می‌گرفت. این عمل باید در دمای دقیق 45˚C در بن ماری انجام شود. در این مرحله که با کمک محلولها کیت انجام می گرفت بر روی نوار مخصوص کیت نوارهای بنفش تیره ظاهر می شدند که با قرار دادن نوار در جدول مخصوص و بررسی نوارهای ظاهر شده نوع جهش بیماران مشخص می گردید.
یافته ها
در این تحقیق 116 بیمار مبتلا به تالاسمی ماژور مورد آنالیز قرار گرفتند. 51درصد آنها دختر و 49درصد پسر بودند. معدل سنی دختران 51/14سال و پسران 28/15 سال بود.7/42درصد بیماران والدین غیر خویشاوند و 3/57درصد آنها والدین خویشاوند داشتند. چون هر فرد دو کروموزوم حاوی ژن بتاگلوبین دارد بنابرین در مجموع 232 کروموزوم مورد بررسی قرار گرفت و انواع جهشهای این بیماران در جدول زیر گرد آوری شده است
جدول 1 : تعداد بیماران انتخاب شده از مناطق مختلف استان خوزستان
منطقه در استان خوزستان
تعداد
درصد
1- اهواز (مرکز خوزستان )
70
35درصد
2-شوشتر - دزفول – اندیمشک - مسجد سلیمان - رامهرمز (شمال خوزستان )
61
5/30درصد
3- خرمشهر - آبادان (جنوب غرب خوزستان )
36
18درصد
4- شادگان (جنوب خوزستان )
18
9درصد
5- دشت آزادگان (غرب خوزستان )
15
5/7درصد
جمع
200
100درصد
1-Polymerization Chain Reation
مقدمه
تالاسمی بتا بعلت کمبود نسبی سنتز زنجیره بتا گلوبین بوجود می آید. در سال 1378 تعداد مبتلایان به تالاسمی ماژور در ایران20 هزار نفر تعداد افراد ناقل 2 تا 3 میلیون نفر گزارش شده است(8). یکی از راه های پیشگیری از تولد بیماران مبتلا به تالاسمی بتا تشخیص قبل از تولد و انجام سقط درمانی می باشد و یکی از گامهای اولیه و ضروری برای این امر شناسایی جهش های شایع در هر قومیت است. چون مطالعه ای جامع که بتواند تمام جمعیت استان خوزستان را در برگیرد تاکنون انجام نگرفته است تصمیم به انجام این تحقیق پیلوت گرفته شد این تحقیق با استفاده ازروش Reveres Dot Blot انجام گرفت.
روش بررسی
بیماران از تمام استان خوزستان بصورت نمونه گیری خوشه ای انتخاب شدند.( جدول 1 ). از هر بیمار 5 میلی لیتر خون در لوله های حاوی EDTA تهیه و برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. آزمایش ها با استفاده از کیت شرکت Vienna Lab ساخت اتریش انجام گردید این کیت دارای تمام مواد مورد نیاز برای انجام آزمایش می باشد. مواد تکمیلی کیت از جمله آنزیم Taq به آن اضافه گردید. هر کیت برای 20 تست طراحی شده بود و هر تست 22 جهش بتا گلوبین را شناسایی می نماید. عمل PCR 1 با شرایط زیر انجام شد.
Pre-PCR: 94˚C/2 min
PCR: [94˚C/10 sec. – 54˚C/15 sec. – 72˚C/45 sec.] – 35 cycles
Final extension: 72˚C/3 min
بعد از انجام PCR محصول آن بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفورز گردید و مشاهده سه باند با اندازه‌های 738 و 596 و 251 جفت بازی دلالت بر موفقیت آمیز بودن مرحله PCR داشت. در مرحله بعدی عمل هیبرید بین محصول PCR و نوار مخصوص کیت انجام می‌گرفت. این عمل باید در دمای دقیق 45˚C در بن ماری انجام شود. در این مرحله که با کمک محلولها کیت انجام می گرفت بر روی نوار مخصوص کیت نوارهای بنفش تیره ظاهر می شدند که با قرار دادن نوار در جدول مخصوص و بررسی نوارهای ظاهر شده نوع جهش بیماران مشخص می گردید.
یافته ها
در این تحقیق 116 بیمار مبتلا به تالاسمی ماژور مورد آنالیز قرار گرفتند. 51درصد آنها دختر و 49درصد پسر بودند. معدل سنی دختران 51/14سال و پسران 28/15 سال بود.7/42درصد بیماران والدین غیر خویشاوند و 3/57درصد آنها والدین خویشاوند داشتند. چون هر فرد دو کروموزوم حاوی ژن بتاگلوبین دارد بنابرین در مجموع 232 کروموزوم مورد بررسی قرار گرفت و انواع جهشهای این بیماران در جدول زیر گرد آوری شده است
جدول 1 : تعداد بیماران انتخاب شده از مناطق مختلف استان خوزستان
منطقه در استان خوزستان
تعداد
درصد
1- اهواز (مرکز خوزستان )
70
35درصد
2-شوشتر - دزفول – اندیمشک - مسجد سلیمان - رامهرمز (شمال خوزستان )
61
5/30درصد
3- خرمشهر - آبادان (جنوب غرب خوزستان )
36
18درصد
4- شادگان (جنوب خوزستان )
18
9درصد
5- دشت آزادگان (غرب خوزستان )
15
5/7درصد
جمع
200
100درصد
1-Polymerization Chain Reation
جدول 2 : فراوانی و درصد انواع جهش های بتا تالاسمی در استان خوزستان
نام جهش
فراوانی
درصد
Condon 36/37
34
7/14درصد
IVS-I -110
33
2/14درصد
IVS – II -1
16
9/6
Condon 8
15
5/6
Codon 5
12
2/5
IVS-I – 25
12
2/5
Codon 44
10
3/4
Codon 8/9
9
9/3
IVS-I -5
8
4/3
Hemo S
7
0/3
IVS-I -745
5
2/2
IVS-I -6
5
2/2
Codon 22
5
2/2
IVS-I -2
4
7/1
- 30
2
9/0
IVS-I -116
2
9/0
Codon 39
2
9/0
Codon 30
1
4/0
ناشناخته
50
6/21درصد
جمع
232
100
جدول 3 : فراوانی جهش های ژن بتا گلوبین بیماران تالاسمی در دو جمعیت عرب و غیر عرب زبان
نام جهش
جمعیت غیر عرب زبان
جمعیت عرب زبان
جمع
Codon 36/37
(درصد3 /17) 14
(درصد 2/8) 8
(درصد 3/12) 22
IVS-I-110
(درصد6/8) 7
(درصد 2/25) 25
(درصد 9/17) 32
IVS-II-1
(درصد9/4) 4
(درصد 3/14) 14
(درصد 1/10) 18
Codon 8
(درصد4/7) 6
(درصد 1/4) 4
(درصد 6/5 ) 10
Codon 5
(درصد6/8)7
(درصد 1/3) 3
(درصد 6/5 ) 10
IVS-I- 25
(درصد 4/7) 6
(درصد 1/5) 5
(درصد 1/6) 11
Codon 44
(درصد0/0)0
(درصد 1/4) 4
(درصد 2/2) 4
Codon 8/9
(درصد 9/4)4
(درصد 1/3) 3
(درصد 9/3) 7
IVS-I- 5
(درصد 5/3) 3
(درصد 0/2) 2
(درصد 8/2) 5
Hemo S
(درصد 2/1) 1
(درصد 1/4) 4
(درصد 8/2) 5
IVS 2/745
(درصد 2/1) 1
(درصد 0/0) 0
(درصد 6/0) 1
IVS-I -6
(درصد7/3) 3
(درصد 0/2) 2
(درصد 8/2) 5
Codon 22
(درصد7/3) 3
(درصد 0/1) 1
(درصد 2/2) 4
IVS-I-2
(درصد 0/0)0
(درصد 0/0) 0
(درصد 0/0) 0
30-
(درصد 5/2) 2
(درصد 0/0) 0
(درصد 1/1) 2
IVS-I-116
(درصد 2/1) 1
(درصد 0/1) 1
(درصد 1/1) 2
Codon 39
(درصد 2/1) 1
(درصد 0/1) 1
(درصد 1/1) 2
Codon 30
(درصد 0/0) 0
(درصد 0/0) 0
(درصد 0/0) 0
ناشناخته
(درصد2/22) 18
(درصد 4/21)21
(درصد 8/21 ) 39
جمع
(درصد100)81
(درصد 100)81
(درصد 100) 179
تحقیق درباره بررسی جهش های ژن شایع بتا گلوبین در بیماران مبتلا به تالاسمی ماژور
